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苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒說明書
微量法 100 管/48 樣
細胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH 在P450 酶系中相當于CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
AH 催化苯胺羥化后產生的 4-氨基酚，進一步轉變為酚-吲哚復合物，在 630nm 處有特征吸收峰；通過測定 630nm 吸光度增加速率，來計算AH 活性。
產品名稱 | DA6006-100T/48S | Storage |
試劑一：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑二：液體 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑三：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑四：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑五：液體 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑六：粉劑 | 1 瓶 | 4℃避光 |
試劑七：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
標準液：液體 | 1 瓶 | 4℃避光 |
說明書 | 一份 | |
試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 100ml 蒸餾水，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水，充分溶解。
試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解。試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水充分溶解。
標準液：液體×1 瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
普通離心機、超速離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、雙蒸水和冰。
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心 30min，取上清液，轉移到超速離心管中。
2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心 60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄
上清液。
4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。
1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調節波長到 630 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑三置于 37℃水浴中預熱 30min。
3. 試劑五置于冰浴預冷 30min。
4. 標準管：取 0.5 ml EP 管，加入 100μl 標準液，100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為A 標準管。
5. 對照管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液，100μl 試劑三，50μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；
再加入 100μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 100μl 上清液，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為 A 對照管。
6. 測定管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液，100μl 試劑三，50μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；
再加入 100μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 100μl 上清液，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為 A 測定管。
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr。
（2） 按樣本質量計算
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。
AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷(W×V 樣)÷T
= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W
C 標準品：10μmol/L；V 標準品：100μl=1×10-4L；稀釋倍數： V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V 樣：加入反應體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應時間（min），30min。
b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下
（1） 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr
（2） 按樣本質量計算
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。
AH 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷(W×V 樣)÷T
= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W
C 標準品：10μmol/L；V 標準品：100μl=1×10-4L；稀釋倍數：V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒； W ：樣品質量； V 樣：加入反應體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應時間（min），30min。
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